Temat obrazu został zaczerpnięty z Księgi Judyty, wchodzącej w skład Starego Testamentu. Wojska asyryjskie pod dowództwem Holofernesa oblegały izraelskie miasto Betulia. Miasto było bliskie poddania się, z powodu głodu i dużych strat wśród obrońców. Zostało uratowane przez Judytę, wdowę po Manassesie.
Odziana w bogate szaty Judyta udała się do obozu asyryjskiego.

olofernes przyjął ją w swoim namiocie i nakazał przygotować ucztę. Judyta pozostała w namiocie Holofernesa na noc, a gdy ten zasnął, obcięła mu mieczem głowę. Wojsko asyryjskie, pozbawione wodza, zmuszone było odstąpić od oblężenia.

Tintoretto namalował chwilę tuż po zabiciu wodza. Judyta nakrywa jego zwłoki leżące na łóżku, a jej służąca chowa głowę zabitego do torby. Zakrwawiony miecz Judyta pozostawiła na podeście łóżka.

Tintoretto nazywany jest czasem weneckim Rubensem. Potrafił bowiem w mistrzowski sposób malować sceny dramatyczne i dynamiczne. Śmiało stosował skróty perspektywiczne. W „Judycie i Holofernesie” ciała wszystkich postaci są przechylone ukośnie w lewo. Linie te równoważone są przez prawą nogę klęczącej służącej, prawą rękę Holofernesa i ręce Judyty, skierowane ukośnie w prawą stronę. Stwarza to wrażenie ruchu i dynamiki.

Jacopo Robusti był synem znanego w Wenecji rzemieślnika, farbiarza, trudniącego się barwieniem jedwabiu. Dlatego do artysty przylgnął przydomek Tintoretto (farbiarczyk).